Forscher entwickeln neue Ligase für biomedizinische Anwendungen

Anonim

Ligasen sind Enzyme, die wichtige Funktionen in Zellen erfüllen und dazu beitragen, gebrochene DNA- und RNA-Stränge miteinander zu verbinden. Diese Enzyme sind auch wichtige biotechnologische Werkzeuge, die bei der genetischen Sequenzierung, Mutationserkennung und anderen Anwendungen nützlich sind.

Forscher an der School of Engineering der Brown University haben jetzt eine neue RNA-Ligase für den Laborgebrauch entwickelt. Die neue Ligase, genannt KOD1Rnl, stammt aus einer Mikrobe, die in der Nähe vulkanischer thermischer Quellen gedeiht. Sie kann bei hohen Temperaturen arbeiten, die für einige Laborverfahren wünschenswert sind. Es ist auch das aktivste in Gegenwart bestimmter RNA-Strukturen, Templates genannt, was es für RNA-Sequenzierung und -Detektion nützlich macht.

"Diese neue Ligase hat alle Eigenschaften, die wir für die Manipulation von RNA als wünschenswert erachten", sagte Lei Zhang, ein Biomedical-Engineering-Doktorand bei Brown und Hauptautor einer Arbeit, die die Arbeit beschreibt. "Wir denken, dass dies ein nützliches Werkzeug für die biomedizinische Werkzeugkiste sein könnte."

Das Papier wird in der Zeitschrift RNA Biology veröffentlicht .

Zhang arbeitet im Labor von Anubhav Tripathi, Professor für Maschinenbau bei Brown und leitender Autor auf dem Papier. "Der Fokus unserer Gruppe lag schon immer auf dem Engineering medizinischer Diagnostik und molekularer Therapien, insbesondere im Umgang mit RNA", sagte Tripathi. "In vielen neueren Studien entwickelten wir neuartige molekulare Tests und Plattformen, um virale Infektionen und das Vorhandensein viraler Mutationen schnell zu erkennen. Während wir die mikrofluidischen Plattformen und die Tests intern entwickelten, bauten wir immer auf Standardreagenzien Wir wurden immer komplizierter, als unsere Designs komplexer wurden, und wir waren zunehmend frustriert angesichts des Mangels an spezialisierten Enzymen wie Ligasen. "

Insbesondere gibt es wenige RNA-Ligasen, die thermostabil sind, dh solche, die bei hohen Temperaturen arbeiten können. Arbeiten mit RNA bei höheren Temperaturen können die Dinge erleichtern, sagt Tripathi. Bei Raum- oder Körpertemperatur sind RNA-Moleküle ein Wirrwarr. Aber beim Erhitzen lockern sich diese Knäuel auf und das Molekül glättet sich.

"Wenn man mit RNA arbeitet, möchte man oft eine komplementäre Nukleinsäure damit hybridisieren", sagte Tripathi. "Das ist viel einfacher, wenn das Molekül linear ist. Wenn es verwickelt ist, sind viele Stellen für die Hybridisierung blockiert."

Das Problem besteht darin, dass die Temperaturen, die zum Ausrichten der RNA benötigt werden, oft zu hoch sind, als dass die Ligase Moleküle effektiv fusionieren könnte. Aber KOD1Rnl ist bis fast 140 Grad Fahrenheit aktiv, was seinen Einsatz bei Laborarbeiten über Körpertemperaturen ermöglicht.

Die Template-Abhängigkeit des Enzyms ist ebenfalls wichtig. Eine matrizenabhängige RNA-Ligase wird zwei RNA-Stränge nur dann fusionieren, wenn ein Strang benachbart zu dem anderen Strang auf einem Templat ausgerichtet ist. Diese Eigenschaft wird von Wissenschaftlern zum Nachweis und zur Sequenzierung von RNA genutzt. Für ihre Arbeit verwendeten Zhang und Tripathi KOD1Rnl, um manipulierte Sonden zum Nachweis von im Labor hergestellten Ebola-RNA-Transkripten zu ligieren.

Die Template-Abhängigkeit ist auch beim Detektieren von Mutationen in RNA nützlich. Dies wird durch Erzeugen von RNA-Sonden-RNA-Strängen erreicht, die eine interessierende Mutation enthalten. Die Sonden haben eine kleine Unterbrechung oder "Kerbe" an dem Punkt entlang des Stranges, an dem die Mutation auftritt. Die Sonden werden dann mit einem Ziel-RNA-Strang in Gegenwart von Template-abhängiger Ligase gepaart oder "hybridisiert". Wenn die Mutation im Zielstrang vorhanden ist, werden die RNA-Sonden richtig hybridisieren, und der Nick wird durch die Ligase verschlossen. Wenn die Mutation nicht vorhanden ist, ist die Struktur des Hybridmoleküls unterbrochen und die Ligase wird den Nick nicht abdichten. Anhand der Frage, ob der Nick verschlossen wurde, können Wissenschaftler feststellen, ob die Mutation vorhanden ist.

Dies alles hängt von dem Ausmaß ab, in dem die Ligase templatabhängig ist, und von ihrer strukturellen Spezifität. Einige Ligasen sind von Natur aus spezifischer als andere. "Wir fanden heraus, dass dies eine hochspezifische RNA-Ligase ist", sagte Zhang von KOD1Rnl. "Es ist spezifischer als existierende Enzyme, die im Labor verwendet werden."

Die Forscher haben das neue Enzym patentiert und hoffen, mit einem Industriepartner zusammenzuarbeiten, um es auf den Markt zu bringen.

"Die Entwicklung von KOD1Rnl ist die erste einer Familie von Enzymen, die wir für die biomedizinische Gemeinschaft entwickeln", sagte Tripathi. "Als biomedizinische Ingenieure träumen wir davon, die Ergebnisse unserer Forschung in die Klinik zu übertragen. Dies ist ein wichtiger Meilenstein, um uns zu diesem Ziel zu bewegen."

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