Multicolor-Super-Resolution-Imaging - Eine Methode zur Überwachung der dynamischen Proteinbindung im Sekundentakt

Microscopy: Measuring Dynamics: Fluorescent Speckle Microscopy (Clare Waterman) (Juni 2019).

Anonim

Forscher des Mechanobiology Institute (MBI) an der National University of Singapore haben eine neue Methode entwickelt, die mittels Super-Resolution-Mikroskopie die Länge von gestreckten Proteinen in lebenden Zellen bestimmt und die dynamische Bindung von Proteinen im Sekundentakt überwacht. Diese Studie wurde im Mai 2016 in Nano Letters veröffentlicht.

Zellen sind ständig mechanischen Kräften ausgesetzt. Diese Signale beeinflussen die zelluläre Entscheidungsfindung, indem sie Informationszellen bereitstellen, die bestimmen müssen, wie viel eines bestimmten Proteins zu produzieren ist, wann ein spezifisches Gen exprimiert werden sollte oder sogar ob sich eine Zelle bewegen oder dort bleiben sollte, wo sie ist. Solche Informationen sind zum Beispiel wichtig für die Erhaltung der Gesundheit, Integrität und Reparatur von Gewebe im Alter. Ein deutliches Beispiel dafür, wann Zellen Kräften ausgesetzt sind, ist, wenn wir gehen. In unseren Muskeln entstehen Dehn- oder Zugkräfte, die durch den Muskel zu Bindegewebe und Knochen geleitet werden. Obwohl diese Information auf einer Gewebeebene erzeugt wird, konvergiert sie auf einzelne Zellen innerhalb dieser Gewebe und wird durch subzelluläre, proteinbasierte Maschinen detektiert und gemessen.

Um die auf eine Zelle wirkenden Kräfte zu messen, können spezialisierte Proteine ​​deformiert sein. Ein üblicher Weg ist, wenn ein Protein gedehnt wird, genauso wie sich ein elastisches Band dehnt, wenn es Zugkräften ausgesetzt wird. Das Strecken von Proteinen kann Bereiche in ihnen freilegen, die sonst verborgen sind. Diese Regionen können als Andockstellen für die Anlagerung anderer Proteine ​​dienen. Dies führt zu einem Schneeballeffekt, bei dem mehr und mehr Proteine ​​in der Lage sind zu binden, und größere molekulare Komplexe oder Maschinen bilden, um eine spezifische zelluläre Funktion zu vermitteln. Dieses Phänomen wurde kürzlich von MBI-Direktor Professor Michael Sheetz, dem leitenden Forschungsbeauftragten Dr. Felix Margadant und der Doktorandin Frau Xian Hu (Edna) in einer Arbeit untersucht, die sich auf die Charakterisierung der Dehnung eines Kraft-sensierenden Proteins namens Talin konzentriert und den Effekt feststellt es hat auf die Bindung eines anderen Proteins namens Vinculin.

Obwohl mehrere Studien das kraftinduzierte Dehnen der Bindung von Talin und Talin-Vinculin in vitro gezeigt haben, war die gleichzeitige Visualisierung dieser beiden Ereignisse und ihrer Korrelation mit spezifischen zellulären Funktionen in lebenden Zellen aufgrund der schnellen Zeitskalen, in denen sie auftreten, nicht möglich. Auch die Durchführung von Mehrfarben-Superauflösungs-Bildgebung in lebenden Zellen ist immer noch sehr schwierig. Um diese Herausforderungen zu bewältigen, entwickelten Prof. Sheatz und Frau Hu eine neuartige und hochentwickelte hochauflösende Bildgebungsmethode, mit der sie gleichzeitig die Länge des Talins in lebenden Zellen sowie die Dynamik der Bindung von Vinkulin auf Einzelmolekülebene und Millisekunde überwachen konnten Zeitstrahl.

Durch die Anlagerung verschiedener fluoreszierender Moleküle (GFP und mCherry) an jedes Ende des Talins und eines dritten Fluorophors (Atto655) an Vinculin konnten die Forscher die genaue subzelluläre Position jedes Proteins überwachen und bestätigen, dass Vinalin gebunden war, wenn Talin gestreckt wurde zu neu exponierten Standorten. Interessanterweise enthüllten ihre Befunde häufig eine Clusterbindung, wobei fünf oder mehr Vinculinmoleküle in einer Sekunde an Talin binden. Darüber hinaus schien die Bindung der ersten Vinculine energetisch die sukzessive Bindung von mehr Vinculinmolekülen zu begünstigen. Die Forscher korrelierten die Vinculin-Bindungsdynamik mit der Menge der Talin-Dehnung und stellten fest, dass die maximale Vinculin-Bindung an einem spezifischen Ende von Talin (der N-terminalen Region) stattfand, wenn Talin auf ungefähr 180 nm gestreckt wurde.

Zu verstehen, wie Talin und Vinculin auf Dehnungskräfte reagieren, ist entscheidend für das Verständnis, wie Zellen auf Kräfte in unserem Körper reagieren. In diesem Fall werden beide Proteine ​​in einer größeren molekularen Maschinerie gefunden, die fokale Adhäsionen genannt werden und das Innere einer Zelle mit dem Material, das die Zelle umgibt, der extrazellulären Matrix, physikalisch verbinden. Fokale Adhäsionen fungieren hauptsächlich als Signalweiterleitungszentren, und die Information, die sie übertragen, kann Zellwachstum und Zellbewegung induzieren. Wenn diese Signalverarbeitung gestört ist oder nicht reguliert wird, entstehen Krankheitszustände und die Fähigkeit des Körpers, Wunden zu heilen oder die Integrität des Gewebes beizubehalten, wenn wir altern, wird beeinträchtigt.

Obwohl die Talin-Vinculin-Wechselwirkung wichtig ist, um diese breiteren Zell- und Gewebeprozesse zu erleichtern, ist sie nur eine von vielen Protein-Wechselwirkungen, die auf die Kraft reagieren. Es ist zu hoffen, dass diese neu beschriebene Methode den Forschern den Weg ebnen wird, andere Proteininteraktionen sowohl innerhalb fokaler Adhäsionen als auch in anderen molekularen Maschinen zu analysieren, um unser Verständnis der vielen kraftgetriebenen zellulären Prozesse während der Entwicklung zu verbessern zum Altern.

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