Kontinuierlich fließende, elektrisch getriggerte Elektroporation auf Einzelzellebene

Symbols of an Alien Sky (Full Documentary) (Juli 2019).

Anonim

Die Doktoranden Mingde 'Jack' Zheng und Joseph Sherba haben eine neuartige mikrofluidische Plattform zur Überwachung der Elektroporation und der molekularen Bereitstellung auf Einzelzellebene im Rahmen eines kooperativen Forschungsteams unter der Leitung der Professoren Jeffrey Zahn und David Shreiber entwickelt Biomedizinische Ingenieure und Professoren Hao Lin und Jerry Shan in der Abteilung für Maschinenbau und Luft- und Raumfahrttechnik an der Rutgers University in New Jersey, Piscataway, NJ.

Elektroporation ist ein weit verbreiteter, sicherer, nicht-viraler Ansatz, um fremde Vektoren in viele verschiedene Zelltypen zu übertragen. Wenn eine Zelle einem elektrischen Feld mit der geeigneten Stärke ausgesetzt wird, erfährt die Membran einen reversiblen elektrischen Durchbruch, wobei sich in der Membran vorübergehende Poren bilden, die einen molekularen Transport in die Zelle ermöglichen. Die kontrollierte intrazelluläre Abgabe von Biomolekülen und Therapeutika ermöglicht die Untersuchung und Entwicklung fundamentaler zellulärer Prozesse und war deshalb ein Schwerpunkt in der biomedizinischen Forschung und der klinischen Medizin. Laut BioMarket Trends ist der Elektroporationsmarkt derzeit das zweitgrößte Segment des gesamten Transfektionstechnologie-Marktes mit einem Umsatz von etwa 200 Millionen US-Dollar, was auf die lipidbasierte Technologie zurückzuführen ist.

Zu den Verbrauchern auf dem Markt gehören diejenigen in der biomedizinischen Forschung in akademischen und Industrielabors sowie Biotechnologie- und Life-Science-Unternehmen, die bestimmte Moleküle in einer Vielzahl von Zellen exprimieren wollen. Darüber hinaus besteht ein zunehmendes Interesse daran, die Transfektionstechnologie klinisch zu verwenden, insbesondere mit dem Aufkommen der CRISPR-Technologie für die Gen-Editierung.

Erfolgreiche Zelltransfektion ist der geschwindigkeitsbestimmende Schritt in zahlreichen biomedizinischen Forschungs- und Bioproduktionsworkflows, einschließlich zellbasierter Therapien, RNA-Interferenz-Screening und Stammzellenforschung. Zu den Herausforderungen gehören variable und schlechte Transformationseffizienz, insbesondere bei schwer zu transfizierenden Zelllinien wie primären Zelllinien und Stammzelllinien. Einer der traditionellen Engpässe bei der Elektroporation bestand darin, eine effiziente Lieferung zu erhalten, ohne die Lebensfähigkeit der Zellen zu beeinträchtigen. Erfolgreiche Elektroporation beinhaltet die Optimierung einer Vielzahl von elektrischen Feld- und Pufferparametern, die durch den Zelltyp und die molekulare Nutzlast beeinflusst werden, um eine ideale Balance der Effizienz der Transfektion (wie viel geliefert wird) mit dem erzeugten Schaden (wie viele Zellen sind) zu erreichen beschädigt oder sterben). Protokolle werden häufig durch kostspielige Versuche und Fehler identifiziert und können von Labor zu Labor und von Anwendung zu Anwendung erheblich variieren. Das interdisziplinäre Forschungs- und Entwicklungsteam von Rutgers konzentriert sich auf translationale Forschung bei der Entwicklung der Elektroporationstechnologie der nächsten Generation für die hocheffiziente Abgabe in Zellen mit überlegener Lebensfähigkeit.

Die Neuheit dieses Berichts ist die Impedanzdetektion der Membranpermeabilisierung in einer Umgebung mit kontinuierlichem Fluss bei beispielloser Empfindlichkeit, eine Leistung, die in der Literatur bisher nicht beschrieben wurde. Durch Überwachung der Änderungen der elektrischen Eigenschaften einzelner Zellen bei Einwirkung von kurzen, hochfesten elektrischen Feldern konnte das Team feststellen, wann eine Zelle permeabilisiert wurde und die Bedingungen bestimmen, die zur molekularen Abgabe führten, während die Lebensfähigkeit der Zellen erhalten blieb. Diese Technologie wird den Transfektionsprozess beschleunigen, indem die Entwicklung von Trial-and-Error-Elektroporationsprotokollen auf sichere und effektive Weise über Zellarten und Anwendungen hinweg eliminiert wird.

Die Mikroelektroporationsplattform wurde nach umfangreichen theoretischen Modellierungen realisiert. Das Team entwarf und fertigte eine mikrofluidische Vorrichtung, die aus einer konvergierenden mikrofluidischen "Elektroporationszone" und einem Satz von Elektroden bestand, die in der Lage waren, sowohl die durchlaufende Zelle als auch den Grad der Zellmembranpermeabilisierung zu pulsen. Der Elektroporations-Mikrochip ist in einen speziell entwickelten LabVIEW-Algorithmus integriert, der den Kanal für den Eintritt einer Zelle in die Elektroporationszone kontinuierlich überwacht. Beim Detektieren einer Zelle wird ein vorgeschriebener elektrischer Impuls an die Zelle angelegt, und das elektrische Signal wird auf Veränderungen der Membranpermeabilisierung überwacht, die letztendlich das therapeutische Nutzlastpotential bestimmt.

Eine weit verbreitete parametrische Studie wurde durchgeführt, indem sowohl die elektrische Feldstärke als auch die Pulsdauer verändert wurden und die Membranimpedanzantwort unmittelbar nach der Pulsapplikation elektrisch gemessen wurde. Der Grad der Membranpermeabilisierung war abhängig von der Intensität der Pulsapplikation, wobei bei einer Pulsdauer von 0, 8 bis 1 ms eine deutliche Erhöhung der Permeabilisierung stattfand. Dieser Trend wurde auch durch die optische Überwachung der Lieferung einer Fluoreszenzsonde, Propidiumiodid, die für Zellen mit intakten Membranen undurchlässig ist, aber bei der Kompromittierung der Membran durch Elektroporation in die Zelle transportiert wird, verifiziert. Es wurde auch gezeigt, dass die Zelllebensfähigkeitstrends von der Stärke und Dauer des angelegten Pulses abhängig sind.

In Zukunft wird das Rutgers-Team die Entwicklung dieser Technologie zu einem "intelligenten", autonomen System fortführen, das in der Lage ist, diese elektrischen Signale zu nutzen, um eine durchflussgesteuerte, feedbackgesteuerte Elektroporationsplattform auf einer einzigen Zellebene zu schaffen. Verbesserungen in der Transfektionseffizienz werden ermöglichen, dass auf Elektroporation basierende zelluläre Transformationsansätze häufiger werden und virale Ansätze ersetzen. Sie stellen sich eine Produktlinie vor, die aus einer Dockingstation für Basisausrüstung und einer Software besteht, die die elektrischen Impulse anwendet und die Permeabilisierung in Echtzeit mit Einweg-Chips für die Handhabung von Zellen und Mikrofluidik überwacht. Das Endergebnis wird eine einfach zu bedienende, reproduzierbare und robuste Produktreihe sein, die den Grundlagenforschungslabors, Entwicklungs- und Produktionslabors im Biotechnologiesektor und schließlich den klinischen Einrichtungen eine breite Palette von Anwendungen eröffnet Interesse an direkter Gen-Editierung oder Transfektion für Transplantations- und Zelltherapien.

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